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AnnexinV/PI雙染凋亡細胞檢測

日期:2015/6/4 14:37:29 人氣:4419

AnnexinV/PI雙染凋亡細胞檢測protocol


一、原理

    磷脂酰絲氨酸(PhosphatidylserinePS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。Annexin V 是一種分子量為35~36kD Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS 高親和力特異性結合。將Annexin V 進行熒光素(FITCPE)或Biotin 標記,以標記了的Annexin V 作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin V PI 匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

二、方法

1、調整待檢測細胞濃度為106/ml,取200ul, 1000rpm×5min(4℃)

2、預冷的PBS1ml 潤洗兩次21000rpm×5min(4℃)

3、將細胞重懸于100ul binding buffer,加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml),輕輕混勻,避光冰上放置15分鐘。

4、轉至流式檢測管,加入400ulPBS,每個樣品臨上機前加入1ulPI50ug/ml),2分鐘后迅速檢測。

5、同時以不加Annexin V-FITC PI 的一管作為陰性對照。

三、注意事項

1、整個操作動作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞。

2、操作時注意避光,反應完畢后盡快在一小時內檢測

四、結果判定

AnnexinV為橫軸,PI為縱軸;

左上象限為機械性損傷細胞;

右上為晚期凋亡細胞或者壞死細胞;

左下為陰性正常細胞;

右下為早期凋亡細胞。

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