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免疫組織化學(IHC)

日期:2015/4/27 9:12:47 人氣:4539


免疫組織化學(IHC)步驟

1.試劑和溶液

乙醇: 無水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇
抗原修復液: 0.01M的檸檬酸鈉緩沖液:58.82g檸檬酸三鈉及7.56g檸檬酸溶于200ml純水,調pH至 6.0,純水1:100稀釋為工作液
3%過氧化氫-甲醇: 30%的過氧化氫與無水甲醇1:9稀釋
10X PBS: 80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L純水,調pH至 7.4
洗滌液: 1×PBS:純水稀釋10× PBS;1× PBST:含0.05% Tween-20 的1×PBS(1×PBST)super block,生物素標記的UltraTek Anti-Polyvalent二抗,酶標親和素UltraTek HRP,DAB
顯色試劑盒:Cat. KT1002a
抗體稀釋液:3%BSA-PBS
0.5%鹽酸-乙醇:0.5~1%鹽酸,95.0~95.5%乙醇
蘇木素:蘇木精2g溶于250ml無水乙醇,十六水合硫酸鋁17.6g 溶與750ml純水,以上溶液充分混合,加入碘酸鈉 0.2g和冰醋酸20ml
2.實驗步驟
1 組織固定:烘箱溫度65-75℃ 30min或者65℃過夜;
2 脫蠟:二甲苯浸泡三次,每次10分鐘;
3 水化:依次經過無水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇浸泡,每次5min;
4 洗滌:自來水沖洗1次,PBS浸泡3min;
5 抗原修復:放入稀釋100倍的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0) 中,高壓鍋煮沸10min,常溫冷卻30min;
6 洗滌:純水浸泡2次,PBS浸泡1次,每次3min;
7 滅活酶:室溫下3%過氧化氫-甲醇暗處處理切片15min;
8 洗滌:純水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;
9 封閉:加入適當體積的super block(KT1002a Reagent A),37℃溫箱孵育5min;
10 洗滌:純水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;
11 一抗:加入反應體積為0.15ml,適合濃度的一抗, 37℃ 濕盒孵育60min。
12 洗滌:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;
13 加入適當體積生物素標記的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗(KT1002a Reagent B),37℃濕盒孵育10min;
14 洗滌:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;
15 加入適當體積酶標親和素UltraTek HRP(KT1002a Reagent C), 37℃濕盒孵育10min;
16 洗滌:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;
17 顯色:滴加適量DAB顯色液(KT1003a)至切片上,室溫顯色1~5min,自來水沖洗;
18 復染:蘇木素染色5min,蒸餾水沖洗5min;
19 分化: 0.5%鹽酸乙醇混合液中分化,自來水沖洗3-4次, PBS中浸泡10-20秒返藍,自來水沖洗2次。
20 脫水:經過70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,無水乙醇浸泡,每次5min;
21 透明:二甲苯浸泡2次,每次10-15min;
22 封片:晾干后加中性樹膠,蓋玻片封片;
23 結果:顯微鏡觀察,記錄結果。
下一個:R&D Systems

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