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免疫印跡(WB)

日期:2015/4/27 8:48:44 人氣:3654


免疫印跡(WB)方法

1.試劑和溶液

1)轉印緩沖液:0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇
2)氨基黑溶液:0.1% 酸性黑10B
3)1×TBST:25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20
4)封閉液:TBST配制的5%牛奶
5)抗體稀釋液:TBST配制的5%牛奶
6)顯色系統:ECL顯色
2.實驗步驟
1 電泳:將裂解液進行SDS-PAGE電泳,80v,30分鐘,120v,90分鐘;
2 轉膜:PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右,濾紙浸泡在轉印緩沖液預濕,半干法轉印到PVDF膜上,10v,150分鐘;
3 染色:氨基黑染色5分鐘,甲醇褪去背景色,觀察條帶;
4 膜活化:將PVDF膜置于甲醇活化1min,用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次;
5 封閉:將膜條置于5%牛奶或2% BSA中,室溫混搖2h;
6 一抗孵育:將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度(參照抗體說明書,根據客戶預實驗結果,稀釋度上下浮動一個數量級都為正常),將膜放入對應的已稀釋待檢樣品中,置4℃混搖孵育過夜;
7 洗滌:取出膜放在TBST中洗滌3×5min;
8 二抗孵育:將膜取出放入稀釋好的HRP標記的二抗(參照二抗說明書進行稀釋)中,室溫混搖2h;
9 洗滌:取出膜放在TBST中洗滌3×5min;
10 ECL顯色:將膜取出放入混勻的ECL顯色液中,孵育3min,將膜取出貼在有熒光角標的膠片上,迅速用保鮮膜包好;
11 曝光:把底片放在暗盒中,根據熒光強度分別對X光膠片作不同時間段的曝光,曝光結束后,將底片取出,1min顯影,30s清洗,1min定影,30s清洗,晾干;
12 結果分析:用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描,做后續結果分析。



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